JPS  >> Vol. 7 No. 3 (August 2019)

    烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)对SD大年夜鼠心血管体系的影响
    Effects of the Alkylating Agent Methyl Methanesulfonate on the Cardiovascular System in SD Rats

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作者:  

蒋天靓,徐贤荣,曹亦菲,李红娟:杭州师范大年夜学医学院预防医学系,浙江 杭州;
干铁儿:浙江省中医院院感科,浙江 杭州;
杨 军:杭州师范大年夜学医学院预防医学系,浙江 杭州;浙江大年夜学医学院从属妇产科医院子宫癌诊疗中间,浙江 杭州

关键词:
甲磺酸甲酯心血管毒性血管张力血小板集合 Methylmethanesulfonate Cardiovascular Toxicity Vascular Tension Platelet Aggregation

摘要:

目标:商量DNA毁伤剂甲磺酸甲酯(MMS)对SD大年夜鼠心血管体系的影响。办法:采取腹腔打针方法赐与SD大年夜鼠甲基磺酸甲酯(25 mg/kg或60mg/kg)。经1天或3天后处逝世大年夜鼠,并检测以下目标:外周血细胞数,血压,心率,血管壁超微构造,胸主动脉张力和血小板集合情况。成果:研究显示,与对比组比拟,在两个剂量组中MMS都可以或许明显增添外周血白细胞数量;然则心率和血压则不受影响。另外,MMS对胸主动脉张力没有影响,电镜分析也发明其对胸主动脉血管壁超微构造没有毁伤。最后,对对比组和MMS处理组停止ADP引诱的血小板集合反响分析发明,两组之间差别无统计学明显性。结论:综上所述,不合于MMS的遗传毒性特点,其对SD大年夜鼠的心血管体系无明显毒性。

Objective: To investigate the effects of DNA damage agent methyl mesylate (MMS) on cardiovascular system in Sprague-Dawley (SD) rats. Methods: SD rats were intraperitoneally injected with MMS (25 or 60 mg/kg). One day or 3 days later, rats were sacrificed and the following parameters were measured and examined: peripheral blood cell count, blood pressure, heart rate, ultrastructure of the vascular wall, thoracic aorta tension, and platelet aggregation. Results: It was found that MMS could significantly decrease the white blood cell counts at both doses compared to controls. On the other hand, heart rate and blood pressure were not affected. In addition, MMS had no effect on the tension in thoracic aorti, and electromicroscopy analysis also revealed no significant damage to the thoracic aortic ultrastructure. Finally, ADP-induced platelet aggregation was evaluated in both MMS-treated and control rats, and the results showed no significant difference between the two groups. Conclusion: Taken together, it is suggested that MMS does not have any significant effect on the cardiovascular system in the rat model.

1. 引言

遗传毒性物质甲磺酸甲酯(methyl methanesulfate, MMS)是经典的DNA烷化剂,能引诱碱基中的嘌呤甲基化,从而招致碱基的错配和DNA复制妨碍,终究形成基因突或染色体畸变 [1] [2] 。MMS作为典范的DNA毁伤剂,是生物医学实验室广泛应用的直接遗传毒物,曾一度在酵母研究被用为拟放射性物质及姐妹染色单体交换引诱剂 [3] ,还被作为聚合、烷化和酯化反响的催化剂和化疗药物而广泛应用 [4] 。MMS的体内水解产品甲磺酸(methanesulfonic acid)亦可作为可逆的虫豸杀虫剂及男性避孕药 [5] 。

今朝对MMS的研究重要集中在DNA的毁伤修复和其遗传毒性效应对生殖器官毁伤和对肿瘤构成的影响 [3] [6] [7] [8] 。大年夜量的风行病学及实验室研究发明很多遗传毒性物质是引诱心血管疾病产生生长的重要风险身分,如多环芳烃类的苯并芘[benzo(α)pyrene, BαP],化疗药物顺铂(cisplatin)等 [9] - [14] 。异样是遗传毒性物质的MMS能否也异样会惹起心血管体系的毁伤呢?今朝为止相干研究甚少。所以本研究的目标就是从血压,心率,血管舒缩及血小板集合功能的变更等多方面来商量MMS对SD大年夜鼠心血管体系形成的影响。

2. 材料与办法

2.1. 材料

2.1.1. 药品与试剂

甲磺酸甲酯(methyl methanesulfonate, MMS)、去氧肾上腺素(phenylephrine, PE)、乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)、二磷酸腺苷(ADP)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)均购自美国Sigma公司(Saint Louis, MO, USA)。其他试剂均为市售级分析纯购自国药集团化学试剂无限公司(上海,中国)。

2.1.2. 实验植物

干净级♂ Sprague-Dawley (SD)大年夜鼠购自浙江省实验植物中间,体重200~250 g,合格证号:SCXK(浙)20080033。大年夜鼠在适应性豢养一周后,以心思盐水作空白对比,一次性腹腔打针甲磺酸甲酯(MMS高剂量组60 mg/kg,低剂量组25 mg/kg),分别染毒1天和3天。另外,于染毒前后,分别测定各组大年夜鼠的体重变更。

2.1.3. 实验仪器

ADVIA2120血液分析仪,德国拜耳公司;BP98A大年夜鼠无创血压仪,日本东京软隆公司;离体血管环灌流装配、MedLab v5.0生物旌旗灯号采个人系,南京美易科技公司;CHORNO-LOG血小板集合分析仪,美国Chrono-Log公司。

2.2. 办法

2.2.1. SD大年夜鼠胸主动脉张力的测定

各剂量组和对比组的SD大年夜鼠用10%水合氯醛0.4 ml/100g腹腔打针麻醉,放血处逝世后翻开胸腔,敏捷游离胸主动脉,置于4℃含95% O2和5% CO2混淆气体预饱和的K-H液中[mmol·L−1 NaCl 120.0;KCl 4.5;CaCl2 1.25;KH2PO4 1.2;MgSO4 1.2;NaHCO3 25.0;葡萄糖10.0 (pH 7.4)],当心剔除四周结缔组织,剪成3~4 mm的血管环。将血管环悬挂于预置5 mL K-H液的离体血管环灌流装配中。血管环两端分别连接张力换能器和浴槽底部的不锈钢丝,应用Medlabv5.0生物旌旗灯号采个人系记录 [15] [16] 。血管环在基本张力为2.0 g的状况下稳定60 min,每15 min换K-H液l次。前后用积累终浓度为10,20,30,40,50,60 mmol·L−1的KCl和积累终浓度为10−9~10−4 mol·L−1的PE安慰血管环紧缩来检测血管的紧缩功能。用10-6 M·L-1的PE 紧缩血管环达峰值,再参加积累终浓度为10−3~10−8 mol·L−1的ACh舒张血管环来检测血管内皮依附性的血管舒张功能。

2.2.2. 血管超薄切片制备及电镜不雅察

固定:将上诉剔除干净外周结缔组织的血管环置于2.5%的戊二醛中浸泡固定住宿,用0.1 mol·L磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗两次,每次15 min。再用1%锇酸固定液固定1 h。固定终了,用PBS漂洗两次,每次15 min。脱水:用2%醋酸铀水溶液染色30 min,然后分别用乙醇和丙酮停止梯度脱水:50%乙醇15 min,70%乙醇15 min,90%乙醇15 min,95%乙醇15 min,100%乙醇20 min,100%丙酮脱水20 min (两次)。渗透渗出:向样品中参加丙酮:包埋液(环氧树脂) = 1:1的包埋液,恒温振荡2 h。包埋:将血管环用纯包埋剂,环氧树脂包埋,恒温振荡1.5~2 h,然后置37℃烤箱24 h烘干,在45℃ (24 h),60℃ (48 h)烤箱内聚合硬化。应用超薄切片机切下厚度约为120 nm的切片,将制备的片子枯燥后先经4%醋酸铀染色20 min,再用枸橼酸铅染色5 min,在TECNAI 10透射电镜下不雅察。

2.2.3. 血小板集合实验

经过过程下腔静脉取血,每只大年夜鼠约取6 ml,用PH = 6.5的柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝(血液:抗凝剂 = 6:1)。150 g·min−1,常温离心20 min,悄悄汲取下层的廓清富血小板血浆(PRP)。残剩血以800 g·min−1离心20 min分别出贫血小板血浆(PPP),用PPP稀释PRP调理血小板计数为250~300 × 106 mL−1。然后,汲取250 ul稀释后的PRP置入集合管,并放入干净磁珠和5 ul 100 mmol·L−1 D的CaCl2于孵育孔道内37℃孵育2 min,置入测试孔道,调零后,参加5ul 100 μmol·L−1的ADP,不雅察集合率的变更,不雅察5 min。

2.2.4. 统计处理

实验成果以情势表示,两组间比较采取t考验,多组间比较采取ANOVA和Dunnett’s t考验法停止明显性分析(SAS9.1统计软件),考验水准为P < 0.05。

3. 成果

3.1. MMS对SD大年夜鼠体重,血压,心率及外周血细胞的影响

一次性腹腔打针MMS后1天,高剂量组60 mg/kg SD大年夜鼠的体重增量仅为4.4 ± 1.6 g,低剂量组25 mg/kg SD大年夜鼠的体重增量为17.9 ± 2.2 g,比拟对比组18.7 ± 1.8 g均有降低,特别是高剂量组的降低明显,降低了76.5%,P < 0.01(表1)。两处理组大年夜鼠的血压(图1)和心率(数据没显示)跟对比组比没有变更,外周血白细计数胞比拟对比组从10.4 ± 0.63 109·L−1降到8.0 ± 0.54 109·L−1 (25 mg/ml)和5.2 ± 0.83 109·L−1 (60 mg/ml),P < 0.01,个中以淋巴细胞和中性粒细胞计数降低最为明显(表2)。红细胞和血小板计数跟对比比没有变更。一次性腹腔打针MMS后3天,高剂量组体重增值为29.9 ± 1.3 g,比拟对比组38.6 ± 1.5 g有明显性差别,向降了22.5%,P < 0.01 (表1),而低剂量组体重增值跟对比比组虽增添,但无统计学差别。两处理组大年夜鼠的血压(图1)和心率(数据没显示)变更跟对比组比仍无差别,而外周血细胞计数变更跟染毒一天后类似(数据没有显示)。

Table 1. The weight gain of SD rats in each group (g)

表1. 各剂量组的SD大年夜鼠体重增长量(g)

x ¯ ± s , **P < 0.01, compared with control.

Figure 1. Systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP) and mean arterial blood pressure (MBP) of BαP-treated and vehicle-treated rats

图1. 各剂量组SD大年夜鼠的紧缩压(SBP),舒张压(DBP),均匀压(MBP)变更

Table 2. Analysis of peripheral blood cells in SD rats 1 day after treated with MMS (109·L−1)

表2. SD大年夜鼠染毒1天后外周血细胞计数(109·L1)

x ¯ ± s , *P < 0.05, **P < 0.01, compared with control.

3.2. MMS对SD大年夜鼠胸主动脉舒缩及其超微构造的影响

KCl和PE是经典的引诱血管紧缩的安慰剂。MMS染毒后第1天,积累浓度为10~60 mmol·L-1的KCl在对比组中引诱血管紧缩幅度为0.11 ± 0.06~0.96 ± 0.08 g;KCl引诱低剂量组(25 mg/kg)SD大年夜鼠胸主动脉紧缩的幅度为 0.12 ± 0.02~0.98 ± 0.10 g,高剂量组(60 mg/kg)为0.25 ± 0.09~0.94 ± 0.10 g (图2(A)~(C))。两处理组跟对比组比拟,血管张力无变更。累计浓度为10−9~10−4 mol·L−1的PE在对比组中引诱血管紧缩的幅度为0.05 ± 0.01~0.44 ± 0.10 g;PE引诱低剂量组SD大年夜鼠胸主动脉紧缩的幅度为0.05 ± 0.01~0.38 ± 0.06 g,高剂量组为0.05 ± 0.01~0.39 ± 0.07 g (图2(A)~(C)),跟对比比拟亦无差别。积累浓度为10−3~10−8 mol∙L−1的Ach在对比组中引诱经PE预紧缩的血管环舒张比为0.11 ± 0.02~1.00 ± 0.03;在低剂量组为0.11 ± 0.02~0.99 ± 0.06;在高剂量组为0.08 ± 0.01~1.00 ± 0.07,处理组跟对比组比较也均无差别。MMS染毒后第3天的血管张力变更与染毒1天的类似(图2(D)~(F))。电镜不雅察SD大年夜鼠胸主动脉壁超微构造显示(图3):两处理组中,不管是血管腻滑肌细胞的分列方法,单位面积的腻滑肌细胞计数(表3)及细胞间的间隙照样线粒体和肌浆网等细胞器跟对比组比拟无异常。

Figure 2. The effect of MMS on thoracic aortic tension of SD rats

图2. MMS对SD大年夜鼠胸主动脉血管张力的影响

Figure 3. The effect of MMS on thoracic aortic ultrastructure of SD rats

图3. MMS对SD大年夜鼠胸主动脉壁超微构造的影响

Table 3. The effect of MMS on smooth muscle cell count (mm−2)

表3. MMS对血管腻滑肌细胞计数的影响(mm2)

3.3. MMS对SD大年夜鼠血小板集合功能的影响

ADP是经典的安慰血小板集合的引诱剂之一。ADP安慰对比组血小板集合的集合率是53.0% ± 5.4%,低剂量组血小板的集合率是56.3% ± 4.2%,高剂量组血小板的集合率是51.9% ± 4.3%,三组比较均无统计学差别,P > 0.05 (图4)。MMS染毒1天,对血小板集合功能不会产生影响。

Figure 4. The effect of MMS on ADP induced platelet aggregation of SD rats

图4. MMS对SD大年夜鼠ADP引诱的血小板集合的影响

4. 评论辩论

表1可知,MMS染毒后1至3天,SD大年夜鼠的体重明显降低,个中染毒后第3天的体重增长量比拟第1天有所上升,解释MMS在体内代谢较快,SD大年夜鼠能在较快时间代偿MMS对机体形成的毁伤。Cumming, R. B.等在小鼠实验中发明,MMS腹腔打针后很快被消化道接收,并快速分布于肝、肾、肺、脾、心脏、附睾、大年夜脑、睾丸、心脏及腻滑肌,24小时后这些脏器中MMS的浓度明显降低 [17] ,这进一步支撑了本实验研究成果。别的,MMS严重降低了外周血白细胞的数量(表2),这能够是MMS对外周血炎症细胞的细胞毒性而至 [18] ,由于有大年夜量文献报导MMS能引诱外周血淋巴细胞遗传物质的改变从而招致细胞凋亡 [19] [20] 。但是,MMS并没有改变SD大年夜鼠的血压(图1),这注解MMS的急性毒性对血管壁张力及血活动力学能够无影响。

图2可知,MMS对KCI和PE引诱的血管紧缩及ACh引诱的内皮依附血管舒张无影响,这提示MMS在体内的急性毒性其实不会搅扰血管腻滑肌正常的舒缩功能。同时图3的电镜图片显示,MMS不管对血管壁的超微构造照样对腻滑肌细胞的数量都没有毁伤,这进一步解释MMS的急性毒性能够不会对腻滑肌的舒缩功能产生影响。此成果也进一步支撑了MMS能够不会招致血压的变更,与图1的成果相吻合。

鉴于心血管体系是个复杂而完全的体系,本研究除检测MMS对血管舒缩,血压,心率及外周血细胞的检测以外,还不雅察了MMS对血栓构成的影响。由于在血栓构成过程当中,血小板激活集合起了相当重要的感化 [21] ,所以本实验采取ADP引诱血小板集合的办法来不雅察MMS能否会对血小板集合功能产生影响,从而初步商量MMS在机体血栓构成中的感化。由图4可知,MMS处理后的大年夜鼠血小板集合率与对比组比拟并没有明显差别,提示急性染毒MMS不会对ADP引诱的血小板集合产生影响,进一步可以揣摸MMS 能够不会促进SD大年夜鼠血栓的构成。其能够缘由为MMS作为经典的DNA毁伤剂,重要以DNA为感化靶点,而血小板缺乏DNA,遭到的影响能够较小。

本研究存在必定的缺乏和局限性。起首,本次实验为摸索性研究,不雅察时间较短,没法评价MMS对SD大年夜鼠心血管体系中远期的影响。另外,由于未不雅察到明显的毒感化,对MMS影响SD大年夜鼠心血管体系的潜伏分子机制未能停止深刻研究。是以,在将来的研究中,须要增长不雅察时间,充分评价MMS对SD大年夜鼠心血管体系的影响及能够的分子机制。

综上所述,固然MMS是公认的遗传毒性物质,能毁伤多器官多细胞的遗传物质,从而招致细胞坏逝世或凋亡,严重影响该器官的心思构造和功能,但MMS的急性毒性其实不会改变大年夜鼠的血压,心率,血管张力及血小板集合功能,即MMS对心血管体系的正常功能并没有明显影响,这能够跟其在体内的快速代谢相干。

基金项目

国度天然迷信基金青年基金(81602795);浙江省天然迷信基金(LZ19H260001, LQ15H26002, LY19H260002)。

NOTES

*第一作者。

#通信作者。

文章援用:
蒋天靓, 干铁儿, 徐贤荣, 曹亦菲, 李红娟, 杨军. 烷化剂甲磺酸甲酯(MMS)对SD大年夜鼠心血管体系的影响[J]. 心思学研究, 2019, 7(3): 17-24. https://doi.org/10.12677/JPS.2019.73004

参考文献

[1] Lundin, C., North, M., Erixon, K., et al. (2005) Methyl Methanesulfonate (MMS) Produces Heat-Labile DNA Damage but No Detectable in Vivo DNA Double-Strand Breaks. Nucleic Acids Research, 33, 3799-3811.
https://doi.org/10.1093/nar/gki681
[2] Beranek, D.T. (1990) Distribution of Methyl and Ethyl Adducts Following Alkylation with Monofunctional Alkylating Agents. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 231, 11-30.
https://doi.org/10.1016/0027-5107(90)90173-2
[3] Wyatt, M.D. and Pittman, D.L. (2006) Methylating Agents and DNA Repair Responses: Methylated Bases and Sources of Strand Breaks. Chemical Research in Toxicology, 19, 1580-1594.
https://doi.org/10.1021/tx060164e
[4] HSDB (2009) Hazardous Substances Data Base. National Li-brary of Medicine.
http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB
[5] Guha, N., Guyton, K.Z., Loomis, D. and Kumar Barupal, D. (2016) Prioritizing Chemicals for Risk Assessment Using Chemoinformatics: Examples from the IARC Monographs on Pesticides. Environmental Health Perspectives, 124, 1823-1829.
https://doi.org/10.1289/EHP186
[6] Kleihues, P., Mende, C. and Reucher, W. (1972) Tumours of the Peripheral and Central Nervous System Induced in BD-Rats by Prenatal Application of Methyl Methanesulfonate. European Journal of Cancer, 8, 641-645.
https://doi.org/10.1016/0014-2964(72)90146-6
[7] Horton, J.K. and Wilson, S.H. (2007) Hypersensitivity Phe-notypes Associated with Genetic and Synthetic Inhibitor-Induced Base Excision Repair Deficiency. DNA Repair, 6, 530-543.
https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2006.10.016
[8] Margulies, C.M., Chaim, I.A., Mazumder, A., et al. (2017) Alkylation Induced Cerebellar Degeneration Dependent on Aag and Parp1 Does Not Occur Via Previously Es-tablished Cell Death Mechanisms. PLoS ONE, 12, e0184619.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0184619
[9] Vaughn, D.J., Palmer, S.C., Carver, J.R., Jacobs, L.A. and Mohler, E.R. (2008) Cardiovascular Risk in Long-Term Survivors of Testicular Cancer. Cancer, 112, 1949-1953.
https://doi.org/10.1002/cncr.23389
[10] De Flora, S. and Izzotti, A. (2007) Mutagenesis and Cardiovascular Dis-eases Molecular Mechanisms, Risk Factors, and Protective Factors. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 621, 5-17.
https://doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2006.12.008
[11] Curfs, D.M., Lutgens, E., Gijbels, M.J., et al. (2004) Chronic Exposure to the Carcinogenic Compound Benzo[a]Pyrene Induces Larger and Phenotypically Different Atherosclerotic Plaques in ApoE-Knockout Mice. The American Journal of Pathology, 164, 101-108.
https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)63101-X
[12] Huddart, R.A., Norman, A., Shahidi, M., et al. (2003) Car-diovascular Disease as a Long-Term Complication of Treatment for Testicular Cancer. Journal of Clinical Oncology, 21, 1513-1523.
https://doi.org/10.1200/JCO.2003.04.173
[13] Huang, M., Jiao, J., Wang, J., Xia, Z. and Zhang, Y. (2017) Exposure to Acrylamide Induces Cardiac Developmental Toxicity in Zebrafish during Cardiogenesis. Envi-ronmental Pollution, 234, 656-666.
https://doi.org/10.1016/j.envpol.2017.11.095
[14] Albert, R.E., Vanderlaan, M., Burns, F.J. and Nishizumi, M. (1977) Effect of Carcinogens on Chicken Atherosclerosis. Cancer Research, 37, 2232-2235.
[15] 徐淑云. 药理实验办法学[M]. 北京: 人平易近卫生出版社, 2002.
[16] 雀苏云, 楼一层, 侯靖. 复方夏枯草活性部位对离体大年夜鼠胸主动脉的舒张感化及机制研究[J]. 中国药师, 2015(6): 884-887.
[17] Monroe, T.J. and Mitchell, M.A. (1993) In Vivo Mutagenesis Induced by CC-1065 and Adozelesin DNA Alkylation in a Transgenic Mouse Model. Cancer Research, 53, 5690-5696.
[18] Tsuyoshi, T., Takeuchi, M., Hirono, H. and Masamoto, Y. (1989) Micronucleus Test with Methyl Methanesulfonate Administered by Intraperitoneal Injection and Oral Gavage. Mutation Research, 223, 383-386.
https://doi.org/10.1016/0165-1218(89)90091-8
[19] Ryk, C., Routledge, M.N., Allan, J.M., et al. (2008) Influence of DNA Repair Gene Polymorphisms on the Initial Repair of MMS-Induced DNA Damage in Human Lymphocytes as Measured by the Alkaline Comet Assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, 49, 669-675.
https://doi.org/10.1002/em.20415
[20] Habas, K., Najafzadeh, M., Baumgartner, A., Brinkworth, M.H. and An-derson, D. (2017) An Evaluation of DNA Damage in Human Lymphocytes and Sperm Exposed to Methyl Methanesulfonate Involving the Regulation Pathways Associated with Apoptosis. Chemosphere, 185, 709-716.
https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2017.06.014
[21] Quinn, M. and Fitzgerald, D. (2005) Platelet Function, Assessment, Diagnosis and Treatment. Humana Press, Totowa, NJ, 3-21.