BIPHY  >> Vol. 7 No. 3 (August 2019)

    应用激光共聚焦显微技巧研究荧光双标记条件下的DAPI光转化效应
    Study on the Photoconversion Effect of DAPI under Fluo-rescent Double Labeling Condition by Confocal Microscopy

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作者:  

姚伟城,刘嘉煜,朱梦迪,胡开顺,王永强:中山大年夜学孙逸仙纪念医院医学研究中间,广东省恶性肿瘤表不雅遗传与基因调控重点实验室,广东 广州

关键词:
DAPI光转化紫外光激光共聚焦显微术 DAPI Photoconversion Ultraviolet Light Laser Scanning Confocal Microscope

摘要:

DAPI作为重要的荧光染料,在细胞核标记实验中被广泛应用。近期有报导指出,DAPI会因紫外光照射而产生光转化效应,光转化后的DAPI可被蓝色光激起而收回绿色荧光旌旗灯号,进而影响荧光不雅察。本文经过过程对细胞核DAPI染色的同时停止细胞质绿色荧光标记,不雅察到DAPI光转化效力明显降低,解释胞质的绿色荧光对胞核DAPI光转化效应产生克制。该研究经过过程激光共聚焦显微手段,对DAPI光转化效应停止不雅察和分析,为多标记荧光实验不雅察供给必定根据。

As an important fluorescent dye, DAPI is widely used in nuclear labeling experiments. Recently, it has been reported that DAPI will produce light conversion effect due to exposure to UV. After light conversion, DAPI can be excited by blue light and emit green fluorescence signal, thus affecting the fluorescence experimental observation. In this paper, the nuclear dye DAPI and green fluorescence were labeled in the same cells, and it was observed that the light conversion efficiency of DAPI was significantly reduced, indicating that the green fluorescence of cytoplasm had an inhibitory effect on the light conversion effect of cell nucleus DAPI. In this study, the light conversion effect of DAPI was observed and analyzed through Laser Scanning Confocal Microscope, providing foundation for the multi-labeled fluorescence experimental observations that DAPI participated in the same time.

1. 引言

DAPI于1971年在Otto Dann的实验室第一次分解,当时作为药物用于治疗锥虫病。后来有研究人员发明DAPI与DNA有较强的结合才能,并渐渐生长成为生命迷信范畴广泛应用的DNA染料,应用于荧鲜明微不雅察、流式细胞术等实验 [1] [2] 。先人的研究显示DAPI重要结合在富含A-T序列的DNA片段区域 [3] ,可被紫外光(UV)激起,在430~470 nm波段产生最大年夜发射,基于如许的荧光特点,DAPI成为细胞荧光多标记实验中重要的荧光染料之一。近期的研究注解,DAPI的激起旌旗灯号和荧光发射旌旗灯号并不是稳定的,在UV处理下DAPI会产生光转化效应,转化后可由蓝光激起并产生绿色荧光发射旌旗灯号 [4] [5] [6] 。是以,在应用DAPI与其他荧光染料结合的实验中,对荧光检测、捕获图象或解释图象时,需防止假阳性的成果。

本文以乳腺肿瘤细胞为实验材料,对细胞停止DAPI和绿色荧光蛋白双标记,在标准卤素灯紫外光照射处理下,经过过程激光共聚焦显微技巧,研究细胞荧光双标记实验不雅察中DAPI光转化效应的变更。经过过程对固定视野下的细胞,不合地位渐渐给光处理的方法,本文不雅察到DAPI的荧光转化效应渐渐产生的过程。在UV照射处理早期,对细胞核蓝色荧光发射和绿色荧光发射分别停止检测分析,发明绿色荧光发射量与蓝色荧光发射质变更成负相干。进一步的分析发明,在DAPI单标记样本中细胞核定位的荧光量总处于相对稳定程度,而双标记样本中细胞核定位的荧光总量呈明显降低趋势,解释双标记能够惹起DAPI荧光转化率降低,然则转化率降低的机制仍不清楚。本文基于UV处理早期的数据研究,对DAPI荧光转移旌旗灯号停止检测和分析,为DAPI参与的多标记荧光不雅察研究供给初步的实验根据。

2. 实验办法和材料

2.1. 试剂

DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购于美国Gibco公司;DAPI购于中国北京leagene公司;4%多聚甲醛、triton-X100、Tween、荧光二抗购于Thermo Fisher Scientific公司;Vimentin一抗购于美国CST公司;DIG标记的oligo探针由苏州泓迅生物公司设计分解,序列为:DIG-GAACCAGGCGACATGGCACATG C-DIG;抗DIG荧光二抗购于Roche公司;抗荧光淬灭封片液购于碧云生成物科技。

2.2. 细胞培养

乳腺癌MCF-7细胞系源于美国形式培养物集存库,应用10%胎牛血清及DMEM Medium培养。将细胞按1 × 105个接种于共聚焦皿中,细胞密度30%~50%,接种后8小时用4%多聚甲醛固定15分钟,备用。

2.3. 探针原位杂交

固定后的细胞用0.5% triton X-100通透,75%酒精变性,−20℃酒精梯度脱水,预杂交后参加双端标有DIG标记的oligo探针于杂交炉中与circRNA原位杂交住宿。杂交停止后冲刷细胞,0.5% BSA封闭,然后参加抗DIG的荧光二抗(494/523 nm)孵育住宿。PBS清洗多余的二抗后,细胞用1 μM的DAPI染色,10分钟后用PBS漂洗细胞三次,吸尽清洗液后滴加抗荧光淬灭封片剂。染色后的细胞用于共聚焦显微镜不雅察或许4℃保存备用。

2.4. 免疫荧光染色

免疫荧光染色,将细胞固定后应用PBST(1X PBS + 0.1% Triton X-100)漂洗3次,每次5分钟,举措柔柔,漂洗后完全去除漂洗液,用1% BSA封闭10分钟。加一抗(抗Vimentin抗体,用1% BSA稀释至1:100)孵育,4℃住宿。收受接收一抗,用PBST (1X PBS + 0.1% Tween)漂洗3次,每次5分钟,漂洗停止后完全去除漂洗液,孵育荧光二抗(抗Rabbit,488 nm;用1% BSA 1:200稀释),室温1小时。孵育完成后收受接收二抗,用PBST(1X PBS + 0.1% Tween)漂洗3次,每次5分钟,漂洗停止后完全去除漂洗液。用0.5 ug/ml DAPI染核,室温孵育5分钟,孵育完成后PBST (1X PBS + 0.1% Tween)漂洗3次,每次5分钟,漂洗停止后完全去除漂洗液。参加抗荧光淬灭剂防止荧光淬灭,放入湿盒中4℃避光保存。

2.5. 荧光成像

应用激光共聚焦显微镜(LCSM 800,Zeiss,Germany)记录图象。实验用波长405 nm和488 nm激光对样本停止激起,分别对波长范围的荧光停止搜集。405 nm激光器和488 nm激光器输入能量设置分别为0.25 mW和0.65 mW。图象处理应用ZEN (blue edition) 软件。应用Lumen Dynamicsx-Cite® exacte荧光光源收回的紫外光停止光转化安慰,采取360/40 nm发射滤光片。

3. 成果

3.1. 紫外光处理条件下DAPI产生光转化效应

本文起首应用DAPI标记乳腺肿瘤细胞核,然后在标准卤素灯紫外光处理下不雅察细胞核的相干荧光旌旗灯号变更。实验过程应用激光共聚焦显微镜不雅察,用405 nm和488 nm激光激起标记了DAPI的细胞核,对预期的蓝色荧光发射(410~530 nm)和绿色荧光发射(498~600 nm)旌旗灯号停止分别检测。实验成果显示未经卤素灯紫外光处理之前,仅能检测到蓝色荧光旌旗灯号,没有绿色荧光旌旗灯号的产生(图1A)。在标准卤素灯紫外光处理部分细胞核以后,处理区域细胞核产生了明显地绿色荧光旌旗灯号(图1B),进一步扩大年夜到全视野处理,在一切细胞核都检测到了强的绿色荧光旌旗灯号(图1C),并且该绿色荧光与细胞核是共定位的。未经DAPI标记的乳腺肿瘤细胞却没有以上景象的产生(本文未列出该数据),解释绿色荧光的产生是源于DAPI的性状变更,产生可被488 nm激光激起收回绿色的荧光旌旗灯号。图1实验显示,绿色荧光旌旗灯号渐渐产生与标准卤素灯紫外光的渐渐处理直接相干,注解紫外光处理条件是招致DAPI产生光转化效应的直接缘由。

Figure 1. UV-Induced Changes of Spectral Characteristics of DAPI. (A) Fluorescence imaging of blue and green channels before UV irradiation; (B) Fluorescence imaging of blue and green channels when UV irradiation of half of the cells in the field; (C) Fluorescence imaging when all the cells under UV treatment. (scale bars = 20 μm)

图1. 紫外光照射处理惹起了DAPI光转化效应。(A) 未经紫外光照射处理之前的蓝色、绿色通道的荧光成像;(B) 对视野内一半的细胞停止紫外光照射处理,检测蓝色和绿色通道的荧光旌旗灯号;(C) 对全视野内细胞停止紫外光照射处理,并检测相干荧光旌旗灯号。(标尺 = 20 μm)

3.2. 紫外光处理条件下DAPI光转化的定量分析

分析DAPI光转化效应与标准卤素灯紫外光照射时长之间的关系,有益于在实验过程当中控制倒霉条件的影响,所以本文进一步记录标准卤素灯紫外光处理下相干荧光旌旗灯号变更,并做了荧光数据统计和分析。成果显示,在标准卤素灯处理早期,随着紫外光照射时间的加长,细胞核定位绿色荧光旌旗灯号渐渐加强(图2A)。对细胞核蓝色荧光和绿色荧光强度统计,成果显示随着标准卤素灯处理时间的加长会惹起DAPI荧光旌旗灯号逐步趋于减弱,而绿色荧光强度则有明显晋升(图2B),在前者的报导中也有类似景象。进一步统计细胞核定位蓝色荧光旌旗灯号和绿色荧光旌旗灯号的荧光总值,发明在标准卤素灯紫外光处理早期细胞核定位的荧光总值处于稳定程度(图2C),注解细胞核定位蓝色荧光量值的增添被绿色荧光量产值高效弥补。图2实验解释,准卤素灯紫外光照射早期,DAPI光转化效力处于比较高的程度。

Figure 2. Detection and statistical analysis of DAPI light conversion effect under UV light irradiation treatment. (A) Detection the fluorescence signal of nuclear localization by laser confocal microscopy (scale = 10 μm); (B) Statistics of blue fluorescence and green fluorescence in A; (C) Statistics on the total fluorescence intensity of nuclear localization. Error bars are ± SD values for three replicates

图2. 紫外光照射处理下DAPI光转化效应的检测与统计分析。(A) 经过过程激光共聚焦显微镜不雅察细胞核定位的荧光旌旗灯号;(B) 对A图中蓝色荧光和绿色荧光停止统计;(C) 对细胞核定位的总荧光强度停止统计。(标尺 = 10 μm)

3.3 细胞质荧光双标记会影响DAPI的光转化效力

DAPI作为重要的多标记荧光染料之一,在细胞荧光不雅察、流式细胞术等实验中广泛应用。为进一步研究DAPI光转化效应在多标记荧光不雅察实验中的影响,本文在乳腺肿瘤细胞原位杂交和免疫荧光实验中,记录标准卤素灯紫外光处理下细胞核和细胞质荧光旌旗灯号的变更情况。实验成果显示,DAPI因标准卤素灯紫外光的照射处理产生光转化效应,细胞核绿色荧光旌旗灯号赓续加强,相反细胞质绿色荧光旌旗灯号渐渐减弱(图3A、图3B、图3C)。紫外光处理早期,对circRNA和波形蛋白分其他单标记荧光实验成果显示,细胞质荧光旌旗灯号渐渐减弱(本文实验未显示)。随后的荧光旌旗灯号统计注解,细胞核定位的荧光总值倒是趋于赓续降低,在标准卤素灯紫外光处理一分钟时已降低至原有总值的50%阁下(图3D)。为确认该景象的可反复性,本文实验反复了三次,取得了雷同的实验趋势。图3实验景象注解,细胞质绿色荧光的标记,直接惹起DAPI光转化效力降低,并且DAPI荧光转化景象对细胞质荧光不雅察并没有明显影响。

4. 评论辩论

本文测验测验分析细胞荧光双标记实验中DAPI光转化效应的变更情况,为细胞多荧光标记实验不雅察以

Figure 3. Detection and statistical analysis of light conversion effects in DAPI-assisted double labeling experiments under UV irradiation. (A) Detection the DAPI fluorescence signal conversion under the conditions of in situ hybridization of circRNA by confocal microscopy (scale = 10 μm); (B) Detecting the DAPI fluorescence conversion signal under the condition of cytoplasmic vimentin green fluorescent labeling (scale = 10 μm); (C) Statistics of blue fluorescence and green fluorescence in graphs A and B; (D) Statistics of total fluorescence intensity of nuclear localization. Error bars are ± SD values for three replicates

图3. 紫外光照射处理下,DAPI参与的双标记实验中光转化效应的检测与统计分析。(A) 经过过程激光共聚焦显微镜不雅察细胞circRNA原位杂交实验条件下的DAPI荧光旌旗灯号转化;(B) 对细胞质波形蛋白绿色荧光标记条件下DAPI荧光转化旌旗灯号检测;(C) 对A、B图中蓝色荧光和绿色荧光停止统计;(D) 对细胞核定位的总荧光强度停止统计。(标尺 = 10 μm)

及分析供给基本根据。

比来的报导显示,紫外光照射可以惹起DAPI和Hoechst 33258产生光转化景象,可由蓝光激起并产生绿色荧光发射旌旗灯号 [4] [5] [6] [7] 。本文经过过程对固定视野下的细胞,不合地位渐渐给光处理的方法,不雅察到了DAPI的荧光转化效应渐渐完成的过程(图1)。同时,本文实验显示,在紫外光照射早期(0~60 s),细胞核定位的荧光产值总量处于相对稳定的程度,也就是说DAPI蓝色荧光发射的减弱,与DAPI光转化产生的绿色荧光发射总荧光量值处于相对稳定程度(图2),解释DAPI光转化效应较为明显。自从发明DAPI荧光转化景象以来,就有研究人员指出其在荧光多标记实验不雅察中须要惹起留意 [5] ,本文对此停止初步的实验分析。分别在细胞原位杂交和免疫荧光实验中,经过过程标准卤素灯紫外光的照射处理,对DAPI光转化效应停止不雅察、记录和分析。实验成果显示DAPI光转化效力会因细胞质荧光的标记而降低,DAPI光转化景象并未对细胞质荧光产生影响(图3),所以DAPI作为多标记实验染料是可行的。为了防止DAPI荧光转化效应对实验不雅察的影响,平常实验操作中最好避开应用卤素灯紫外光通道寻觅视野,而改用白光或许红、绿、蓝通道。本文的研究显示,DAPI光转化受外部荧光搅扰而降低转化率,出现更多的荧光淬灭景象,但相干机制有待进一步的研究。

基金项目

国度天然迷信基金(81772821)赞助。

文章援用:
姚伟城, 刘嘉煜, 朱梦迪, 胡开顺, 王永强. 应用激光共聚焦显微技巧研究荧光双标记条件下的DAPI光转化效应[J]. 生物物理学, 2019, 7(3): 27-33. https://doi.org/10.12677/BIPHY.2019.73033

参考文献

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