AMB  >> Vol. 8 No. 3 (September 2019)

    氯化苦泥土消毒对三七栽种后真菌群落构成及多样性的影响
    Effects of Fumigation with Chloropicrin on Soil Fungal Composition and Diversity after Continuous Cropping of Panax notoginseng

  • 全文下载: PDF(2471KB)    PP.121-129   DOI: 10.12677/AMB.2019.83015  
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作者:  

吕 艺,赵 娅,毛煦东,刘 洋,肖 瑶,罗 婷,林连兵,王 峰:昆明理工大年夜先生命迷信与技巧学院,云南 昆明;
崔秀明:昆明理工大年夜先生命迷信与技巧学院,云南 昆明;云南省三七栽种重点实验室,云南 昆明

关键词:
三七根际泥土真菌群落ITS测序轮作妨碍Panax notoginseng Rhizosphere Soil Fungal Community ITS Sequencing Continuous Cropping Obstacle

摘要:

三七是我国独有的宝贵中药材,喜暖和而阴湿的情况,这类情况极易引发其根腐病构成,招致轮作妨碍的产生。氯化苦是一种具有挥发性的泥土薰蒸剂,今朝,采取其停止泥土消毒是防治三七土传病害的有效办法。本研究中,我们采取基于Illumina MiSeq平台的ITS高通量测序技巧研究氯化苦消毒后三七栽种地中泥土真菌群落构成、多样性的变更。成果注解,氯化苦消毒后的三七根际泥土与未消毒的根际泥土比拟真菌群落构成、多样性存在明显差别,并且经氯化苦消毒后,罕见的重要三七致病真菌镰刀菌属(Fusarium)占比出现极大年夜降低,从消毒前的7.42%降低到消毒后的1.97%,而对三七发展有益的木霉属(Trichoderma)真菌占比则出现相对降低(从消毒前的14.70%增长到消毒后的23.45%)。这些成果注解氯化苦消毒在三七轮作妨碍的防治中可以影响真菌群落的构造和构成,招致病原菌和有益菌占比产生变更,这类变更关于三七栽种地泥土情况的改良、菌群构造的均衡和泥土微生态的自我修复具有重要意义。

Panax notoginseng is one of the most valuable traditional Chinese medicine, which usually grows under warm and humid environment and thus has high mortality in root rot caused by continuous cropping. Currently, soil fumigation with chloropicrin (CP) is an effective way to avoid this. In this study, ITS sequencing based on Illumina MiSeq platform was employed to analyze the structure and diversity of fungal community in the soil samples with or without CP fumigation. We found that fumigation with CP had a remarkable effect on the composition of soil fungal community. Especially, the relative abundance of harmful genera, for example, Fusarium, was significantly decreased from 7.42% to 1.97%, while the abundance of friendly genera, for example, Trichoderma, was remarkably increased from 14.70% to 23.45%. Our results provide new insights for CP fumigation in promoting self-reparation of soil microecosystem and controlling root rot in Panax notoginseng caused by disordered fungal community.

1. 引言

三七(Panax notoginseng)是一种传统的宝贵中药材,主产于云南文山,具有“止血、散瘀、定痛”等功能 [1] [2]。要想取得高质量、高品德的三七,必须持续栽种三年或三年以上。但是,长时间的持续栽种使三七极易遭到土传病害的进击,如根腐病、灰霉病、黑斑病、疫霉病、锈腐病、白粉病和圆斑病等,个中根腐病是三七最罕见病害之一 [3] [4]。以后,已报导的三七根腐病病原菌重要有腐皮镰孢菌、细链格孢菌、坏损柱孢菌和黄腐病菌等 [5] [6],由此招致的损掉终年在5%~20%阁下,最高可达70% [7] [8]。三七的轮作妨碍成绩严重制约其栽种周期和产量,极大年夜的降低了地盘的应用率,个中根际微生物的静态变更是三七轮作妨碍的重要因子之一,也是今朝的研究热点。

氯化苦的化学称号是三氯硝基甲烷,其分子式为CCl3NO2,可用于粮食薰蒸,泥土、植物种子消毒等 [9] [10]。氯化苦泥土熏蒸消毒可有效杀灭各类泥土病原微生物,研究注解,其对有害细菌、真菌的杀灭率均在85%以上,可以极大年夜的降低相干土传病害的侵染率,并且由于氯化苦具有很强的挥发性,其在泥土中残留量极低,今朝,美国、日本、以色列、我国山东等地已有较大年夜面积的应用 [10] [11],然则其在三七栽种和轮作妨碍防治中的应用报导较少,特别是氯化苦施用后对三七泥土中真菌群落的影响还没有见报导。

随着基因组学测序技巧的迅猛生长,基于真菌ITS序列的免培养高通量测序办法已成为研究泥土样品中真菌群落构造和构成的重要对象 [12]。基于此,本研究采取Illumina MiSeq测序平台,经过过程构建小片段DNA文库停止双末尾(paired-end)宏基因组学测序取得泥土样品中真菌的物种构成及其丰度信息,并经过过程α多样性分析、β多样性分析对氯化苦消毒前后的三七栽种地中真菌群落构成和多样性的变更做一体系的分析。

2. 材料和办法

2.1. 研究区概略

实验于2016~2017年在云南文山州七麟三七科技无限公司三七栽种基地实验田停止,实验地处于云南省西北部低纬度高原地区(东经103˚43'~104˚27',北纬23˚06'~23˚44'),实验区属中亚热带季风气候,均匀相对湿度75%,年均降雨量1187.8 mm。实验场地实施同一化、迷信化和标准化管理,采取人工建棚(同一遮阳网覆盖)方法停止三七栽培。

2.2. 泥土样品收集

实验采取田间小区型实验设计,设无熏蒸消毒和熏蒸消毒两个处理。无熏蒸消毒处理为对比,即泥土不做任何处理;熏蒸消毒处理为用氯化苦消毒泥土,详细操作办法为用耕地机将土翻开20公分,按照30公斤每亩用量喷洒氯化苦消毒剂,消毒剂喷撒后用薄膜将其罩住停止熏蒸消毒20天,以后揭去薄膜,再天然晾晒半个月停止轮作栽种。因氯化苦是易挥发化学物质,且有剧毒,必须在透风情况内,佩带防毒面具操作。其它大年夜田管理和三七稼穑操作等均按照惯例管理停止。泥土采样办法为5点法(即:每块地分五个不合地点采样,设置三个反复)。样品收集深度为地下10~20 cm,土样收集后,先用4 mm土筛停止挑选,然后装入高温冰盒中停止贮存,带回实验室放入−80℃超高温冰箱,用于宏基因组学测序。

2.3. 泥土真菌基因组总DNA的提取

按照SPIN Kit for Soil试剂盒(Mpbio公司,美国)解释书供给的操作步调,从泥土样品中提取真菌宏基因组DNA并停止电泳检测后,于−20℃冰箱中冷冻保存DNA样品。

2.4. PCR扩增与测序

将提取并纯化后的泥土总DNA作为PCR扩增的模板,采取ITS序列的通用引物停止PCR扩增,引物序列为ITS-F:GCATCGATGAACGCAGC,ITS-R:TCCTCCGCTTATTGATATGC [13]。PCR扩增的实验条件为:95℃预变性2 min,退火温度为55℃,时间为30 s,链延长温度为72℃,时间为30 s,合计停止30次轮回,终究72℃延长5 min。扩增完成今后,取10 μL扩增产品停止1%琼脂糖凝胶电泳检测,并停止上机测序。一切样品测序均在美因安康科技(北京)无限公司停止,重要办法为采取Illumina MiSeq高通量二代基因测序体系,经过过程构建小片段文库停止双末尾(paired-end)测序,reads读长为250 bp。

2.5. 数据分析

测序数据分析的重要流程为起首对原始数据(Raw reads)停止拼接、过滤,取得Clean Tags,Clean Tags经过嵌合体的去除取得有效数据(Effective Tags),然后基于质控合格的有效数据停止后续生物信息分析,根据特定的阈值(默许拔取97%)停止OTU (Operational Taxonomic Units)聚类,结合今朝的微生物学威望数据库Unite [14] 停止物种注释和分类。详细包含以下贱程:1) 去除Reads两真个Barcode和Primer序列;2) 应用Qiime [15] 供给的脚本应用Read1和Read2之间的堆叠区停止拼接,拼接后的序列为Raw Tags。拼接采取fastq-join办法,拼接过程请求堆叠区的最小长度为10 bp,最大年夜错配率为10%;3) 对Raw Tags停止质控,截断掉落含5个以上持续N或低质量碱基的Tags,并进一步过滤掉落持续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags,从而取得Clean Tags;4) 去除Clean Tags中的嵌合体,嵌合体即PCR扩增过程当中产生的缺点序列。嵌合体的检定采取UCHIME算法 [14],与Unite数据库比对,嵌合体序列去除后即取得作为后续数据分析的Effective Tags;5) 最后按照97%的序列分歧性将每个样本测序产生的一切Effective Tags聚类为OTU,并将OTU代表性序列与物种注释停止比对分析,统计各个样品在各个分类程度菌群构成和分布情况,并采取Chao1指数、Shannon指数等对测序数据停止菌群丰富度和多样性等目标的分析 [16] [17] [18]。

3. 成果与分析

3.1. OTU分析

为了研究样品的真菌群落构成及其多样性信息,我们按照97%的序列类似性标准将Effective Tags聚类成OTU (Operational Taxonomic Units,即分类操作单位,是指在体系产生学研究或群体遗传学研究中,为了便于停止分析,工资给某一个分类单位设置的同一标记)。各样品的OTU数量统计成果如图1(a)所示。为了更直不雅的展示不合样品之间特有和共有的OTU,根据分析成果进一步绘制Venn图(图1(b)),成果注解,经过氯化苦消毒后真菌的OTU数量整体降低了42.06%,个中消毒后样品中约有64.70%的OTU与未消毒样品雷同,并新增长了326个OTU。

Figure 1. OTU number counting (a) and Venn diagram analysis (b) of soil samples without or with chloropicrin fumigation

图1. 未消毒对比及氯化苦消毒处理后泥土样品OTU数量统计(a)及Venn图分析(b)

3.2. 氯化苦消毒对泥土真菌群落多样性的影响

图2所示,三七栽种后地盘经氯化苦消毒后,真菌菌群丰富度指数(Chao1)和多样性指数(Shannon)均有所增添,该成果与上述OTU分析成果分歧。个中,Chao1指数主如果计算群落丰度(Community Richness),用于估计群落样品中包含的物种总数,Chao1指数越大年夜,微生物群落丰富度越高。Shannon指数重要用于计算群落多样性(Community Diversity),该指数受群落中物种丰富度和均匀度(Community Evenness)的合营影响,Shannon指数越大年夜,微生物群落多样性越大年夜。在如图2(b)所示的未消毒和消毒样品中,Shannon指数均达到5以上,注解氯化苦消毒后真菌群落多样性实际上仍处于较高程度。

Figure 2. Rarefaction curves generated for fungal ITS from soil samples without or with chloropicrin fumigation ((a) Chao1 index; (b) Shannon index)

图2. 未消毒对比及氯化苦消毒处理后泥土真菌ITS多样性稀释度曲线((a) Chao1指数;(b) Shannon指数)

3.3. 氯化苦消毒对泥土真菌群落门程度的影响

图3(a)所示的物种相对丰度分布柱形图可知,氯化苦未消毒及消毒样品中均匀丰度最高的10个门,分别为子囊菌门(Ascomycota)、结合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、纤毛亚门(Ciliophora)、罗兹菌门(Rozellomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、丝足虫门(Cercozoa)、绿藻门(Chlorophyta)和被子植物门(Anthophyta)。个中,子囊菌门、结合菌门、担子菌门为未消毒泥土样品中的优势菌群,它们分别占土样真菌总数的63.25%,17.40%和6.40%;子囊菌门、担子菌门和壶菌门为氯化苦泥土消毒样品中的优势菌群,它们分别占土样真菌总数的72.73%,4.26%和3.17%。由图3(b)所示的物种丰度聚类热图可知,担子菌门(Basidiomycota)、纤毛亚门(Ciliophora)、球囊菌门(Glomeromycota)、被子植物门(Anthophyta)、丝足虫门(Cercozoa)、绿藻门(Chlorophyta)、罗兹菌门(Rozellomycota)、结合菌门(Zygomycota)真菌在消毒后数量明显增添;壶菌门(Chytrdiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)真菌在消毒后数量出现明显增长。

Figure 3. The relative abundance of species (a) and their heatmap (b) on the level of fungal community in the horizontal of the phylum without or with chloropicrin fumigation

图3. 未消毒对比及氯化苦消毒处理后泥土真菌重要门程度分布柱形图(a)及丰度聚类热图(b)

3.4. 氯化苦消毒对泥土真菌群落属程度的影响

图4(a)所示的物种相对丰度分布柱形图可知,氯化苦未消毒及消毒样品中均匀丰度最高的10个属,分别为木霉属(Trichoderma)、被孢霉属(Mortierella)、毛壳菌属(Chaetomium)、曲霉菌属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、隐球菌属(Cryptococcus)、假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)、明梭孢属(Monographella)、孢子菌属(Spizellomyces)和柄孢壳属(Zopfiella)。个中,木霉属、被孢霉属、毛壳菌属为未消毒泥土样品中的优势菌群,它们分别占土样真菌总数的14.70%,8.44%和8.11%;木霉属、曲霉菌属和毛壳菌属为氯化苦泥土消毒样品中的优势菌群,它们分别占土样真菌总数的23.45%,7.51%和3.00%。由图4(b)所示的物种丰度聚类热图可知,赤霉属(Gibberella)、裂壳菌属(Schizothecium)、镰刀菌属(Fusarium)、伞状霉属(Umbelopsis)、隐球菌属(Cryptococcus)、假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)、明梭孢属(Monographella)、毛壳菌属(Chaetomium)等真菌在消毒后数量增添;木霉属(Trichoderma)、红酵母属(Rhodotorula)、陆地真菌属(Westerdykella)、柄孢壳属(Zopfiella)、根瘤菌属(Rhizophlyctis)、孢子菌属(Spizellomyces)和曲霉菌属(Aspergillus)等真菌在消毒后数量出现增长。这些成果从属的角度注解氯化苦消毒前后泥土中真菌群落构成与构造具有明显的不合。

Figure 4. The relative abundance of species (a) and their heatmap (b) on the level of fungal community in the horizontal of the genus without or with chloropicrin fumigation

图4. 未消毒对比及氯化苦消毒处理后泥土真菌重要属程度分布柱形图(a)及丰度聚类热图(b)

3.5. Beta多样性分析

Beta多样性分析主如果对不合组样本之间的微生物群落构成及其差别停止研究。在Beta多样性分析中,常选用Bray-Curtis间隔来衡量两个样品间的相异系数,其值越大年夜,表示这两个样品在微生物构成、物种丰度和多样性方面存在的差别越大年夜。一切样本的Bray-Curtis间隔heatmap热图如图5所示,该成果注解两个样本之间的类似性较低,即氯化苦消毒前后泥土真菌群落构造不合。

Figure 5. Heatmap of beta diversity index based on Bray-Curtis distance

图5. 基于Bray-Curtis间隔的Beta多样性指数热图

4. 评论辩论与结论

由于三七发展合适范围狭小,栽种周期在三年以上,其轮作妨碍成绩异常凹陷,研究发明,在三年生三七地盘中,持续移栽栽种三七苗,一年后,所移栽植株简直全部产生根腐病害 [19]。在如许的条件下,合适栽种三七的地盘赓续增添,病原微生物数量增多,自毒效应明显,严重影响三七家当的生长。三七轮作妨碍实际上是泥土生态体系中各类身分综合感化的成果,这些身分重要包含泥土理化性质、微生物群落、泥土酶活性、泥土自毒物质的积聚和农作物身分等,个中泥土根际微生物群落构造的改变是最重要的影响身分之一 [20] [21] [22]。近期一项与草莓栽种相干的研究注解,氯化苦消毒可以进步泥土的理化性质,调剂细菌和真菌的菌群构造,进而增长草莓产量 [23],并且,经过过程和二甲基二硫醚结合应用,氯化苦还可以很好的控制轮虫和镰刀菌茂盛病的产生 [24]。是以,要防止三七轮作妨碍,可以先应用氯化苦实施泥土薰蒸、消毒处理等办法,尽可能增添泥土中有害病原菌数量,进步三七轮作后有益菌占比,促进泥土微生物的静态演替和菌群构造均衡 [25] [26] [27]。

经久以来,经过过程实验室培养等传统办法能测到的微生物数量只占其总数的0.1%至10% [28],这使得泥土微生物构成及其构造不克不及取得全体周全的研究。近年来,由于Illumina高通量测序技巧的迅猛生长,基于宏基因组学高通量测序技巧的相干研究大年夜大年夜进步了我们对泥土微生物多样性的熟悉并促进了对很多未知微生物的摸索 [29]。本研究中,我们经过过程对氯化苦消毒前后三七根际泥土真菌ITS测序及宏基因组学分析发明,氯化苦消毒后的三七栽种地中泥土真菌群落及其多样性与未消毒泥土比拟存在明显差别,然则不管是未消毒对对比样氯化苦消毒泥土样品,子囊菌门(Ascomycota)均是真菌群落中的第一大年夜类群,占比60%以上。以后关于泥土致病真菌的研究注解,镰刀菌属(Fusarium)是引发三七根腐病的罕见致病菌 [30],本研究发明经氯化苦消毒后,镰刀菌属真菌占比出现极大年夜降低,它们从消毒前的7.42%降低到消毒后的1.97%;与之相对应,木霉菌属(Trichoderma)是罕见的对三七发展有益的真菌,经氯化苦消毒后,它们的占比出现相对降低,从消毒前的14.70%增长到消毒后的23.45%。这些成果在必定程度上注解氯化苦消毒会招致三七根际泥土中的菌群,特别是病原菌和有益菌占比产生改变,我们认为这类优势菌群的变更关于根际泥土微生态的自我修复、三七栽种地泥土情况的改良和后续轮作作物的发展具有重要意义。

基金项目

云南省科技厅严重年夜科技项目(No. 2017ZF001);云南省2018年大年夜先生创新创业练习筹划项目(No. 201810674019)。

NOTES

*第一作者。

#通信作者。

文章援用:
吕艺, 赵娅, 毛煦东, 刘洋, 肖瑶, 罗婷, 崔秀明, 林连兵, 王峰. 氯化苦泥土消毒对三七栽种后真菌群落构成及多样性的影响[J]. 微生物前沿, 2019, 8(3): 121-129. https://doi.org/10.12677/AMB.2019.83015

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